TP Bioinformatique ESIL 2ème Année

Objectifs

Réaliser l'analyse fonctionnelle détaillée d'une famille de protéines, exclusivement à l'aide d'outils Internet.

A la fin de ce travail, vous devez avoir

• déterminé precisément les éléments fonctionnels de la proteine étudiée, par analyse de séquence, notamment:
  • identifié tous les domaines de la protéine
  • localisé tous les résidus essentiels, les éventuels sites catalytiques et de liaison au(x) substrat(s)
• déterminé l'existence de protéines orthologues et paralogues
• determiné dans quel ensemble d'organismes on retrouve cette fonction.

Le protocole implémenté s'approche de celui recommandé par Bork et Koonin (Nature genetics, 1998, 18, 313), bien que la fonction de la protéine étudiée soit en fait déjà connue. Les resultats seront inclus dans un rapport synthétique.

Vous devez trouver les sites web vous-même en vous aidant des pointeurs donnés en cours ou des moteurs génériques (google, etc.)

Protéines Proposées. Elles présentent l'intérêt de contenir plusieurs domaines (parfois réutilisés dans d'autres protéines), d'avoir un homologue de structure 3D connue, et d'avoir plusieurs paralogues.

2004: polyadenylate-binding protein 2 de Arabidosis thaliana

Conseils Généraux:

• Sauvegardez en HTML les resultats intermediaires de façon à pouvoir éventuellement relancer certaines recherches (Attention: les sorties de Blast sont énormes. Faites le ménage à la fin du TP.)
• Sauvegardez les graphiques intéressants (format JPG ou GIF) pour une insertion eventuelle dans le rapport.
• Utilisez au maximum les bookmarks-signets pour éviter d'avoir à retrouver à chaque fois les sites utiles.

a) Récupération de la séquence

• En vous aidant des mots-clé, récupérez la séquence protéique de départ avec Entrez ou SRS.
• Sauvegardez la séquence sur votre compte Windows.

b) Eléments structuraux

Le but est ici de repérer toutes les régions susceptibles d'interférer avec les véritables homologies.

• Régions transmembranaires. Utiliser pour les prédire l'un des sites Web de prediction existant (par ex. TMHMM). Note: si les protéines proposées ne sont pas transmembranaires, testez la prédiction avec une véritable transmembranaire, par ex: Swissprot P27732 (obtenue par SRS).
• Répétitions internes: Utiliser Lalign, un programme du package Fasta qui produit à partir de 2 séquences tous les alignements locaux "intéressants". Utiliser le serveur http://www2.igh.cnrs.fr/bin/lalign-guess.cgi
  Plusieurs alignements significatifs indiquent des répétitions.
• Régions de basse complexité: elles seront filtrées (remplacées par des N) automatiquement lorsque vous utiliserez Blast au NCBI (option filter: default). Si vous êtes curieux(se), vous pourrez désactiver cette option lors du Blast et voir en quoi elle affecte les résultats.
• Séquences Alu, Sine, L1, etc.: Elle peuvent être filtrées en utilisant "advanced Blast" (On ne se pose pas la question pour les séquences procaryotiques).

c) Identification de domaines/motifs connus.

Première approche pour l'identification des domaines et/ou motifs fonctionnels de la protéine: la recherche dans les banques de motifs et de domaines.

• Identifiez les motifs potentiels en interrogeant le serveur Prosite. Lisez la documentation des motifs trouvés (Lignes "DO" ou "PDOC" de la fiche Prosite)
• Identifiez les domaines potentiels au moyen du serveur PFAM.

d) Recherche de similitude

On recherche ici divers homologues à notre séquence de départ. Le mot DIVERS est très important car on veut identifier les résidus conservés pour des raisons fonctionnelles. Dans cette collection, on peut garder des orthologues et des paralogues.
• Rechercher des homologues avec le serveur Blast (advanced) du NCBI. Faites la recherche au niveau protéique.
• Collecter les séquences qui paraissent homologues à votre séquence de départ. La lecture de la fiche Swissprot de la protéine de départ (si elle existe, ou d'un article de Review sur cette fonction) peut s'avérer utile, ainsi que l'observation des régions conservées: les résidus ayant donné lieu au bon score Blast élevé sont effectivement fonctionnellement importants.
  ATTENTION:
  • Utiliser la bonne banque et la bonne version de Blast. Vous cherchez des protéines, et vous en voulez le plus possible!
  • Dans les réponses, vous obtiendrez parfois des artefacts. Attention aux 'ALU warning' et autres matches inintéressants!
  • Attention aux valeurs de E: si c'est trop élevé, vous avez intérêt à être certain que les séquences sont homologues.
  • Vous obtiendrez peut-être plusieurs fois la même protéine sous des noms différents, ou des mutants sans intérêt.
  • Il ne s'agit pas de garder aveuglément les N meilleures séquences. Ne perdez pas de vue l'objectif de diversité.
• Recherches iteratives par Blast pour récupération d'homologies eloignées. Des homologies reelles peuvent avoir échappé à la première recherche. Refaites la recherche avec au moins deux itérations de PSI-Blast (toujours serveur du NCBI).
• Tentez de classer toutes les séquences obtenues en orthologues/paralogues. Identifier les régions d'homologie (un paralogue peut être similaire à la séquence de départ sur un domaine seulement).
  

e) Alignement multiple

C'est à partir d'un alignement multiple que l'on identifiera les résidus essentiels. On en tirera des conclusions sur la catalyse, la liaison au substrat ou tout autre aspect fonctionnel.
• Vous aurez possiblement deux alignements à faire:
  
• un alignement global vous donnera les résidus communs à l'ensemble des séquences sélectionnées (peut ne rien donner si les protéines sont trop variables)
  
• l'alignement restreint à un domaine, comprenant orthologues et paralogues: pour observer les résidus importants dans cette fonction précise.
  
• Réalisez l'alignement multiple avec le serveur Clustalw disponible a l'EBI (European Bioinformatics Institute). Cochez l'option treetype=NJ.
• Vous récupérez un alignement et un arbre. Sauvegardez l'arbre en format "Phylip" (arbre parenthésé) et affichez-le avec le programme Treeview. Vérifiez vos hypothèses sur les paralogues et orthologues.
• Importez l'alignement dans un traitement de texte. Numérotez les résidus, repérez domaines et aa conservés. Rapprochez ces résultats de ce qui est connu de l'activité et de la structure de la protéine (voir fiche Swissprot, connaissances personnelles ou articles).

f) Validation 3D

Les structures des protéines choisies possèdent des homologues de structure résolue (au moins partiellement) par RMN ou cristallographie. Vous avez donc la possibilité d'expliquer la présence et la nature des résidus conservés par des arguments structuraux.
• Retrouvez des structures pdb homologues à votre séquence en faisant un blastp contre la banque pdb.
  
• Récupérez la structure et visualisez-là avec Rasmol
• Identifiez les éléments secondaires visuellement et dans le fichier pdb (parfois listés dans les commentaires), comparez avec les signatures que vous aurez etablies. Vous pouvez cliquer sur la structure afin d'identifier des residus particuliers.
• Option: produire une sortie graphique (JPG, GIF) à inclure dans le rapport.

g) Rapport

• Introduction sur les objectifs du travail
  
• Matériel et Méthodes: sites Web et logiciels utilisés
• Resultats et Discussion: Pour chaque etape du TP, donnez le but, le resultat et la conclusion que vous en tirez.
• Ne copiez pas dans votre texte tous les resultats que vous avez obtenu (par ex. pas d'alignements de blast, sauf pour discuter un point particulier). La sortie graphique de Blast est utile. Si l'alignement Clustal fait plus de 3 pages, ne montrez que les regions interessantes.
• En conclusion, faites intervenir les connaissances réelles sur la protéine étudié (un peu de bibliographie, ou au moins une bonne lecture des fiches Swissprot, peuvent s'averer utile).